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发酵工艺中感染噬菌体的原因及如何杀灭噬菌体

更新时间:2023-11-23   点击次数:241次
01概述
噬菌体是感染细菌、真菌、藻类 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称,因部分能引起宿主菌的裂解,故称为噬菌体。当发酵液受到噬菌体严重污染时,可能会对发酵过程产生不良影响,甚至导致整个发酵过程的失败。因此,在发酵过程中,要采取有效的预防和控制措施,避免发酵液受到噬菌体污染。这包括加强发酵设备、原材料、水质等方面的卫生管理,以及定期进行微生物学检测和噬菌体检测等。
02噬菌体的主要特性
1)专一的寄生性。噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖,只能在活的、处于繁殖阶段的细胞中生长繁殖,不能脱离宿主而自行生长繁殖。如果不同菌株的亲缘关系比较近,那么此菌株也是会感染的,特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意,在换新菌株之前必须了解其背景。
2)不耐热性。游离的噬菌体在45℃条件下10min就可使其失活。
3)不耐药性。直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等都可使其失活。


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五种有尾噬菌体的基本结构及其结构蛋白所在的部位
03噬菌体染菌的现象1)发酵周期延长,甚至产物生成量减少或停止;2)发酵(OD值)光密度不上升或回降;3)pH逐渐上升;4)氨利用停止;5)糖耗、温升缓慢或停止;6)产生大量泡沫,发酵液呈黏胶状;7)发酵液变清,镜检时菌体数量显著减少,甚至找不到完整的菌体。


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典型的噬菌体感染周期
04噬菌体的检查方法
1)样品处理:将细菌样品混合于缓冲液中,加入适量的噬菌体,混合均匀。将混合液在室温下放置一段时间,使噬菌体充分感染细菌。
2)细菌培养:将上述混合液涂布在合适的固体培养基上,于恒温器中培养一段时间,使细菌生长并被噬菌体感染。3)噬菌斑检测:观察培养皿上的菌落,寻找由于噬菌体感染而形成的透明斑,即噬菌斑。用记号笔标记噬菌斑的位置。4)定量检测:可以采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或聚合酶链式反应(PCR)等方法,对噬菌体进行定量检测。
5)宿主范围检测:将不同的细菌菌株与噬菌体共同培养,观察是否能形成噬菌斑。通过这种方式可以检测噬菌体对不同细菌的感染能力,即宿主范围。
6)生物学特性分析:对噬菌体的生物学特性进行分析,如基因组大小、感染能力、复制周期等。这些特性可以反映噬菌体的种类和特点,有助于对其进行分类和研究。


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05怎么样控制噬菌体对发酵的危害
5.1  感染噬菌体的原因
① 菌种本身带噬菌体,特别是溶源性噬菌体,对这种菌种,一经发现,应立即弃去② 发酵车间环境里噬菌体随空气进入发酵罐污染。尽管发酵罐有空气过滤器,但如果环境空气存在噬菌体,空气过滤器无法过滤拦截,从空气过滤原理得知只能拦截一部分的噬菌体。③ 罐体、管道清洗消毒不到位,或时间久了存在管道顽固性生物膜给予的再次污染。
④ 车间管理的疏忽大意。认为发酵只是发酵车间的事情与其他无关,其实预防噬菌体必须人人参与,提高意识,各部门配合且长期坚持下去。
5.2  杀死噬菌体的方法1)物理方法:可以采取高温灭菌、紫外线辐射、过滤等方法去除噬菌体。这些方法简单易行,但也有其局限性,比如过滤方法只能去除噬菌体的一部分,而高温灭菌和紫外线辐射对设备和物品也会造成一定的损害。2)化学方法:可以使用化学消毒剂去除噬菌体,例如过氧乙酸、氯气等。这些化学消毒剂具有强烈的杀菌作用,可以去除大部分的噬菌体,但也需要注意消毒剂的浓度和使用方法,以避免对生产设备和人员产生不利影响。3)生物方法:可以使用其他细菌或病毒对噬菌体进行防治,例如利用具有广谱杀菌作用的细菌或利用分子生物学技术针对特定的噬菌体进行干预。这些方法相对于物理和化学方法而言更加精准和有效,但也需要特定的技术和设备支持。5.3  预防噬菌体的措施
(1)五大误区
① 精度为0.01um的空气过滤器能阻拦噬菌体空气。过滤器中的0.01um的精度不是单指膜的精度,他是把布朗运动、撞击等拦截都计算在内的,故0.01um只是个相对精度,实际上膜的绝对精度在0.2um左右,故0.01um的空气过滤器可以挡住一部分噬菌体,但不能挡住。用过滤器的洗脱液经电镜观察,可以看到噬菌体的存在。
② 噬菌体不耐热,65℃以上的温度可杀死噬菌体。我们所说的热灭菌是指达到一定的温度并维持一定的时间,使微生物致死的过程,可在实际生产中我们经常会遇到温度达到了使噬菌体致死的温度,可是却杀不死噬菌体,主要原因在于维持时间不够。这就很容易解释为什么空气在进罐前就已经加热到70C,可噬菌体仍然能活着进罐。
③ 噬菌体对药物敏感。甲醛等消毒剂可杀死噬菌体原理同上,虽然药的浓度和剂量足够,可是如果维持时间不够仍起到不杀菌效果。用5%的甲醛对全厂区喷洒,而后在环境中取样测定,仍有很多活噬菌体。
④ 预防噬菌体是发酵车间的事情,与其他车间无关。噬菌体的防治是要上下齐动手,人人都参与。发酵要做好是需要各部门配合且长期坚持下去。
⑤ 生产正常时,对噬菌体的警惕可以放松一点了。对于噬菌体的防治,我们要做到时刻警惕。
(2)严格活菌排放放
由于噬菌体缺乏独立代谢的酶体系,不能脱离寄生而自行生长繁殖,因而噬菌体的繁殖必须依存于寄生菌的繁殖,噬菌体只能在活的、正处于生长繁殖阶段的细胞中进行繁殖,而在死的、老的或休眠状态的细胞中以及代谢产物上都不能繁殖。因此,如果我们能够不让活的生产菌在环境中生长蔓延,也就切断了噬菌体的食物来源,破坏了噬菌体的滋生场地和繁殖条件。
① 每次上罐前对发酵罐进行空气试漏处理,防止由于设备原因造成活菌的外泄和噬菌体的进入。
② 在接完种后,必须对残余种子液、接种瓶、种子罐及其连接管道附件等用蒸汽或药物消毒,没经过灭活处理的种子液不得排入污水池。
③ 在发酵过程中,需要知道细菌的生长情况,要求定时取样对发酵液进行检测分析。取样最好在无风的条件下进行,取样口下方需设一个装有碱液((pH≥11)的容器,除了加盖取样瓶中的料液外,其余料液必须全部进入该碱容器,切勿喷洒或直接进入下水道。取完样后,要用消毒水对取样者的手、取样瓶、装碱容器和以取样品为中心的上下左右1m的空间进行立体的喷洒;取样瓶需装在盛有消毒水的容器中直到化验室。
④ 化验室检测的对象就是带有活菌的料液,检测完pH后的电极需先用新洁尔灭冲洗,冲洗水入pH≥11的碱桶中;测OD时,移取原液的移液管或移液枪头须入碱水浸泡,比色管、比色器皿用新洁尔灭清洗浸泡30min后才可继续使用;离心管用新洁尔灭清洗浸泡30分钟后才可继续使用,且离心后固相及其清洗水须入碱桶中,凡是与料液有直接接触的液体废弃物须入碱桶,严禁直接排入下水池;凡是与料液有直接接触的固体废弃物须有pH≥11碱水浸泡2h后方可废弃。
⑤ 在发酵罐运行过程中有大量的尾气要外排,而这尾气中就含有活菌体,故尾气需经过处理并且要排到远离车间100m以上的车间下风口位置。
(3)环境卫生,消灭噬菌体与杂菌
① 加强环境消毒:车间内部用漂白水和新洁尔灭轮流对所有地面角落进行喷洒,定点放置固体二氧化氯,使车间内部能闻到淡淡的药味。每天早晚一次对车间地沟用漂白粉消毒,保持地沟内清洁无积水。车间周围用二氧化氯、漂白粉每天喷洒2次。
② 加强普查力度:定期(3天1次) 对车间内部和车间周围环境中的杂菌含量进行普查统计,重点部位要求每天普查,对测得不合格的区域进行重点消毒,并且分析杂菌的来源。定期检测噬菌体案例与检测空气中噬菌体的方法。
③ 车间四周、角落及楼周围不要乱堆东西,要保持整齐、清洁,定期清扫、冲刷,撒漂白粉或石灰等。
④ 加强对蛇管的检查力度。特别是弯头和焊接部分,极易受到料液的腐蚀而穿孔。蛇管中循环水的压力一般大于罐内压力,不管穿孔多少,水中的噬菌体会源源不断的进入发酵罐中,需特别引起重视。


发酵罐噬菌体污染如何解决


(4)严防噬菌体进入种子罐或发酵罐内
a.种子
1)使用本身带有噬菌体的菌种。
2)种子室与发酵车间分开、远离,使种子工作不处于有噬菌体和杂菌污染的环境中,以确保种子进行的第一环不染噬菌体。
3)加强噬菌体检测工作。定期检测环境中噬菌体,掌握噬菌体情况。
b.严格无菌操作
① 加强种子室灭菌、无菌操作及安全卫生措施。感染噬菌体的培养物不得带入无菌室、摇瓶间(因噬菌体可透过纱布棉塞飞扬),种子室应尽量减少与外界接触。
② 二级种子接种时停风扇关门窗,用焰火封闭。
③ 消灭设备死角。定期检查设备,尤其是种子罐,罐顶、挡板、冷却管、罐底.搅拌器、罐壁与节门等处、渗漏及结垢,及时解决。设备要易于清洗与维修。管路要简化,阀门要可靠。
④ 认真进行培养液、发酵设备、空气净化系统及管路的消毒工作。
c.净化空气
在发酵中,因为需要大量通入空气,所以必须高度注意由空气而来的污染。噬菌体在干燥状态比湿润状态稳定,从空气中分离到的耐干燥的噬菌体,能长时间存活而浮游于空气中,是造成噬菌体污染的重要原因,要特别重视。


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(5)感染噬菌体后的发酵罐及其相关联的系统处理
1)发酵罐要经过空消121℃,30min→5%甲醛100°C,4h→4%碱水100°C,4h→空消121℃,30min处理;2)所有与罐体直接相连的阀门拆下来肢解后用4%碱水浸泡4h,然后组装好试压 (0.8MPa的压缩空气)不漏后待用。3)物料管道用5%甲醛熏蒸4h,然后用4%热碱水浸泡30min以上,用清水清洗干净备用。4)移种管道用5%甲醛熏蒸4h,煮罐后的碱水通过移种管道排出,再用蒸汽消毒1h,要求每个排污阀都要微开,确保有水或汽排出。
5)把补料罐先清空,补料管道用5%甲醛熏蒸4h,煮罐后的碱水通过移种管道排出,再用蒸汽消毒1h,要求每个排污阀都要微开,确保有水或汽排出。
6)放料管道用5%甲醛熏蒸4h,煮罐后的碱水通过放料管道排出,再用蒸汽消毒1h。
7)空气总管用5%甲醛熏蒸4h,要求每个支路都要消到,再用蒸汽冲刷3h,最后用空气吹干。
8)配料槽储料槽等用4%热碱水浸泡4h。
9)取样瓶等用消毒水或碱水浸泡。
10)空气过滤器重消吹干后备用。
奥克泰士在发酵生产领域的作用和优势:
1)广谱型杀菌,一种产品就能全面杀灭细菌、真菌等,包括芽孢、噬菌体、耐热菌、霉菌、杂菌等各种类型微生物。
2)有效应对高抗性微生物污染,高数量等级微生物污染。
3)多用途,适用于发酵车间环境、管道、发酵罐、水处理系统等等各环节的消毒杀菌工作。
4)食品级生态型,产品性状为无色无味的透明液体,作用完毕后分解为水和氧气。
5)良好的材料兼容性,基本无腐蚀,保护设备材料。
6)来自德国,提供德国和欧盟先进的微生物控制理念。
7)相关案例支持,拥有丰富的微生物处理经验。8)根据现场具体的微生物状况,提供科学针对性的解决方案。


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